Cancer Cell | 湯富酬課題組與付衛(wèi)課題組合作揭示結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的遺傳變異
腫瘤微環(huán)境是由腫瘤組織中的各種非上皮細(xì)胞以及胞外基質(zhì)共同組成的，其中非上皮細(xì)胞主要包括腫瘤浸潤的各種免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，而腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞又包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。這些細(xì)胞通過與癌上皮細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用影響了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。近年來單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到腫瘤微環(huán)境研究中，但是這些微環(huán)境細(xì)胞究竟被癌細(xì)胞馴化到何種程度，特別是腫瘤微環(huán)境細(xì)胞是否發(fā)生了遺傳改變等問題仍然沒有得到深入研究。
近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)了人類正常組織的上皮細(xì)胞中普遍存在基因突變，并且“正常”組織上皮細(xì)胞中突變的大量積累被認(rèn)為是一種潛在的癌前病變機(jī)制[1]。然而對(duì)于大片段的基因組拷貝數(shù)變異（somatic copy number alterations, SCNAs）的研究仍然主要依賴大量細(xì)胞混合樣品的基因組測序（bulk sequencing），這種方式只能檢測到頻率較高（>5%）的克隆性拷貝數(shù)變異，容易忽視潛在的低頻率、非克隆性的基因組拷貝數(shù)變異，有可能極大地低估了基因組拷貝數(shù)變異在人類“正常”組織中的普遍性[2, 3]。
2020年10月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組與北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)課題組合作在國際知名學(xué)術(shù)期刊Cancer Cell上發(fā)表題為“Single-cell Multiomics Sequencing Reveals Prevalent Genomic Alterations in Tumor Stromal Cells of Human Colorectal Cancer”的研究論文。該研究從21例微衛(wèi)星穩(wěn)定的結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中獲取了癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織、癌旁組織以及外周血樣品，同時(shí)從6例非癌癥個(gè)體中獲取了外周血樣品，對(duì)多種非上皮細(xì)胞進(jìn)行了高精度的單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組雙組學(xué)測序。該研究首先建立并優(yōu)化了一項(xiàng)單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組雙組學(xué)測序技術(shù)，通過對(duì)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行分離，使得對(duì)同一個(gè)單細(xì)胞能夠同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和基因組測序。并在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究了腫瘤微環(huán)境以及正常組織中免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中基因組拷貝數(shù)變異的發(fā)生頻率和特征，揭示了腫瘤微環(huán)境中發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細(xì)胞存在特異性克隆擴(kuò)張現(xiàn)象；同時(shí)，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了5個(gè)腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物，均與結(jié)直腸癌預(yù)后密切相關(guān)（圖1，2）。
圖1. 研究的主要發(fā)現(xiàn)概述
圖2. 取樣、測序和分析的方案設(shè)計(jì)
該研究有3個(gè)主要發(fā)現(xiàn)：
（1）以基因組拷貝數(shù)變異為代表的遺傳變異在人體正常組織的各種免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛存在。
在該研究中，研究人員利用單細(xì)胞雙組學(xué)測序技術(shù)對(duì)來自21例結(jié)直腸癌患者以及6例未患癌癥的正常人的總計(jì)15,312個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析。根據(jù)細(xì)胞類型特異性表達(dá)的標(biāo)記基因，這些細(xì)胞被分為8個(gè)主要細(xì)胞類群，包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及其他髓系免疫細(xì)胞。令人驚訝的是，即使在非癌的正常組織中，所有細(xì)胞類群中都發(fā)現(xiàn)有1%-15%的細(xì)胞存在>10 Mb的基因組拷貝數(shù)變異。這說明很可能所有人類個(gè)體體內(nèi)的主要細(xì)胞類型都存在百分之幾的細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異等遺傳異常，遺傳異常不是局限于人體內(nèi)上皮細(xì)胞中的特殊現(xiàn)象，而是所有主要細(xì)胞類型中都存在的普遍現(xiàn)象。這些發(fā)生了永久的、不可逆的遺傳異常的人體細(xì)胞有可能參與了人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。
通過單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)不僅在腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中存在發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的遺傳異常的免疫細(xì)胞（1.3%-11.2%），癌旁“正常”組織浸潤的免疫細(xì)胞（0.9%-9.7%）、結(jié)直腸癌患者的外周血（1.1%-11.5%）以及未患癌癥的個(gè)體的外周血（2.9%-10.2%）中都存在較高比例的遺傳異常的免疫細(xì)胞。研究人員一共從8,982個(gè)通過嚴(yán)格基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控的免疫細(xì)胞中鑒定出538個(gè)（6.0%）發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的細(xì)胞?？截悢?shù)變異在每一位結(jié)直腸癌患者（3.0%-11.2%）和每一位未患癌癥的正常人（2.9%-10.2%）的免疫細(xì)胞中都普遍存在。通過研究發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體的分布，研究人員發(fā)現(xiàn)在女性個(gè)體中，整條X染色體的丟失發(fā)生頻率最高（單個(gè)細(xì)胞中兩條X染色體缺失一條，從XX變?yōu)閄O），在男性個(gè)體中整條Y染色體的丟失發(fā)生頻率最高（從XY變?yōu)閄O），而常染色體的拷貝數(shù)變異似乎是隨機(jī)分布的（圖3）。有基因組拷貝數(shù)變異的血管內(nèi)皮細(xì)胞在癌旁組織（0.0%-1.4%）、結(jié)腸腸系膜血管內(nèi)皮（3.7%-14.9%）和癌組織（3.9%-12.8%）中也都普遍存在。
圖3. 有基因組拷貝數(shù)變異的免疫細(xì)胞在不同個(gè)體中普遍存在
（2）腫瘤組織中發(fā)生遺傳異常的成纖維細(xì)胞的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁正常組織，并且遺傳異常的成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中發(fā)生了顯著的克隆擴(kuò)張。
研究人員從來自7例結(jié)直腸癌患者癌旁組織的664個(gè)成纖維細(xì)胞中僅發(fā)現(xiàn)37個(gè)細(xì)胞發(fā)生了基因組拷貝數(shù)變異，不同患者癌旁組織里成纖維細(xì)胞中遺傳異常細(xì)胞的比例為1.1%-10.6%，而在來自9例結(jié)直腸癌患者癌組織的1,183個(gè)成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了333個(gè)發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的細(xì)胞，不同患者腫瘤組織成纖維細(xì)胞中遺傳異常細(xì)胞的比例為11.1%-47.7%，相比于癌旁 “正常”組織比例增加了4倍左右（圖4）。而且癌旁組織中成纖維細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異呈現(xiàn)相對(duì)隨機(jī)的分布特征，而腫瘤組織成纖維細(xì)胞中顯著富集7號(hào)染色體拷貝數(shù)增加的細(xì)胞。在88個(gè)來自腫瘤組織發(fā)生7號(hào)染色體拷貝數(shù)變異的成纖維細(xì)胞中，有85個(gè)細(xì)胞存在整條7號(hào)染色體拷貝數(shù)增加，并且這85個(gè)細(xì)胞中位于7號(hào)染色體上的基因的平均表達(dá)水平要顯著高于（增加了26%）沒有基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細(xì)胞。7號(hào)染色體拷貝數(shù)增加的特異性富集提示了腫瘤微環(huán)境中發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的遺傳異常的成纖維細(xì)胞的克隆擴(kuò)張（圖5）。這說明腫瘤微環(huán)境細(xì)胞不是簡單地接受癌上皮細(xì)胞的“誘導(dǎo)”而被動(dòng)地參與腫瘤發(fā)生過程，而是已經(jīng)發(fā)生不可逆的、永久的遺傳變異，因而很可能主動(dòng)地促進(jìn)了癌上皮的腫瘤發(fā)生過程。遺傳變異不是像原來普遍認(rèn)為的那樣只發(fā)生在腫瘤上皮細(xì)胞中，而是也廣泛發(fā)生在非上皮的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中。
圖4. 發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在癌旁“正常”組織中的比例
圖5. 腫瘤組織中的成纖維細(xì)胞顯著富集7號(hào)染色體拷貝數(shù)增加的細(xì)胞
（3）發(fā)現(xiàn)了5個(gè)腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞特異表達(dá)的腫瘤標(biāo)志基因，它們的表達(dá)水平均與結(jié)直腸癌預(yù)后密切相關(guān)。
研究人員鑒定出腫瘤組織中成纖維細(xì)胞相對(duì)于癌旁組織中成纖維細(xì)胞差異表達(dá)的76個(gè)基因，包括59個(gè)上調(diào)基因和17個(gè)下調(diào)基因。其中BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2在腫瘤組織成纖維細(xì)胞中明顯上調(diào)，經(jīng)TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證，其高表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后差明確相關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這5個(gè)基因在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境成纖維細(xì)胞中特異性高表達(dá)，確定了這5個(gè)基因是腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志基因（圖6）。這一發(fā)現(xiàn)拓展了腫瘤標(biāo)志基因的種類，從原來主要聚焦于癌上皮細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志基因變成同時(shí)關(guān)注腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志基因。而且腫瘤微環(huán)境細(xì)胞特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志基因更有可能具有跨不同癌種的普適性，其臨床應(yīng)用場景可能更廣泛。
圖6. 與結(jié)直腸癌預(yù)后密切關(guān)聯(lián)的成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志基因
綜上所述，本項(xiàng)研究利用高精度單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)，深入系統(tǒng)地分析了27個(gè)人類個(gè)體的多種非上皮細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異情況，揭示了基因組拷貝數(shù)變異普遍存在于人體成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞中發(fā)生基因組拷貝數(shù)異常細(xì)胞的比例大幅度增加，而且這類遺傳異常的成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中存在克隆擴(kuò)張現(xiàn)象。此項(xiàng)研究突破了人們對(duì)人體“正常”組織中細(xì)胞遺傳變異的認(rèn)知，充分證明了以基因組拷貝數(shù)變異為代表的遺傳變異在人群中普遍存在，在人體主要細(xì)胞類型中普遍存在，提示基因組拷貝數(shù)變異在人類疾病和衰老中可能存在重要作用，并對(duì)腫瘤微環(huán)境和腫瘤治療研究提供了新的線索。
北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）博士生周圓、卞舒惠博士（現(xiàn)為生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室PI）、博士生崔月利以及北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科周鑫主治醫(yī)師為該論文的并列第一作者。北京大學(xué)未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心湯富酬教授和北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)教授為該論文的共同通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了國家自然科學(xué)基金和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）的支持。
原文鏈接：https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(20)30489-X
參考文獻(xiàn)：
1. Yizhak, K. et al. RNA sequence analysis reveals macroscopic somatic clonal expansion across normal tissues. Science 364, aaw0726, (2019).
2. Jacobs, K. B. et al. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat Genet 44, 651-658, (2012).
3. Laurie, C. C. et al. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat Genet 44, 642-650, (2012).
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com